Cromatografía líquida de alta resolución de contaminantes naturales y de aguas residuales. Cromatografía líquida de alta resolución La esencia del método de cromatografía líquida de alta resolución
(OFS 42-0096-09)
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un método de cromatografía en columna en el que la fase móvil (MP) es líquida
hueso que se mueve a través de una columna cromatográfica llena de
la fase visual (sorbente). Las columnas de HPLC se caracterizan por una alta presión hidráulica en la entrada de la columna, por lo que HPLC a veces se denomina
llamado "cromatografía líquida de alta presión".
Dependiendo del mecanismo de separación de sustancias, se distinguen los siguientes:
Opciones generales de HPLC: adsorción, distribución, intercambio iónico,
exclusivo, quiral, etc.
En la cromatografía de adsorción, la separación de sustancias se produce debido a su diferente capacidad para ser adsorbidos y desorbidos con el aumento de
superficie del adsorbente con una superficie desarrollada, por ejemplo, gel de sílice.
En HPLC de partición, la separación se produce debido a la diferencia en los coeficientes de distribución de las sustancias a separar entre las inmóviles
(generalmente injertado químicamente en la superficie de un soporte fijo) y
fases móviles.
Por polaridad, PF y NF HPLC se dividen en fase normal y ob-
rotación de fase.
La fase normal se llama una variante de la cromatografía, en la que
use un sorbente polar (por ejemplo, gel de sílice o gel de sílice con
NH2 trenzado - o CN-grupos) y PF no polar (por ejemplo, hexano con diferentes
suplementos personales). En la variante de fase reversa de la cromatografía,
utilizar sorbentes modificados químicamente no polares (por ejemplo,
radical alquilo no polar C18) y fases móviles polares (por ejemplo,
metanol, acetonitrilo).
En la cromatografía de intercambio iónico, las moléculas de las sustancias de la mezcla, disociación
en solución en cationes y aniones, se separan al pasar por
sorbente (intercambiador de cationes o intercambiador de aniones) debido a sus diferentes tasas de intercambio con iónico
mi grupos del sorbente.
En exclusión (tamiz, penetración en gel, filtración en gel)
Las moléculas de cromatografía de las sustancias se separan por tamaño debido a su diferente capacidad para penetrar en los poros de la fase estacionaria. Al mismo tiempo, el primero de
de las columnas salen las moléculas más grandes (de mayor peso molecular) que pueden penetrar en el mínimo número de poros de la fase estacionaria,
y las sustancias con tamaños moleculares pequeños salen en último lugar.
A menudo, la separación se produce no por uno, sino por varios mecanismos al mismo tiempo.
El método HPLC se puede utilizar para controlar la calidad de cualquier nega-
analitos similares. Para el análisis, se utilizan instrumentos apropiados: cromatógrafos líquidos.
La composición de un cromatógrafo de líquidos suele incluir los siguientes elementos básicos
nodos:
– Unidad de preparación de FP, incluido un contenedor con una fase móvil (o un contenedor
sti con solventes individuales que son parte de la fase móvil
zy) y sistema de desgasificación PF;
– sistema de bombeo;
– mezclador de fase móvil (si es necesario);
– sistema de inyección de muestra (inyector);
– columna cromatográfica (se puede instalar en un termostato);
– detector;
– sistema de recogida y tratamiento de datos.
Sistema de bombeo
Las bombas suministran el PF a la columna a una tasa constante dada. La composición de la fase móvil puede ser constante o variable.
durante el análisis. En el primer caso, el proceso se llama isocrático,
y en el segundo - gradiente. A veces instalado delante del sistema de bombeo
filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm para filtrar la fase móvil. Moderno
El sistema de bombeo variable de un cromatógrafo de líquidos consiste en una o más bombas controladas por una computadora. Esto le permite cambiar el
convirtiéndose en PF según un programa específico con elución en gradiente. Sme-
la mezcla de los componentes PF en el mezclador puede ocurrir tanto a baja presión
iones (antes de las bombas) y a alta presión (después de las bombas). El mezclador se puede utilizar para la preparación de PF y la elución isocrática,
sin embargo, se logra una proporción más precisa de los componentes con pruebas preliminares.
mezcla de componentes de PF para un proceso isocrático. Las bombas HPLC analíticas permiten mantener un caudal constante de PF en la columna en el rango de 0,1 a 10 ml/min a una presión de entrada de columna de hasta 50 MPa. Es aconsejable, sin embargo, que este valor no supere
chalo 20 MPa. Las pulsaciones de presión se minimizan mediante una amortiguación especial
Sistemas de casquillos incluidos en el diseño de bombas. Piezas de trabajo en-
Las bombas están hechas de materiales resistentes a la corrosión, lo que permite el uso de componentes agresivos en la composición del PF.
grifos
Por diseño, los mezcladores pueden ser estáticos o dinámicos.
micrófono
En el mezclador, se forma una única fase móvil a partir de
disolventes específicos suministrados por bombas, si la mezcla necesaria no se ha preparado con antelación. La mezcla de solventes generalmente ocurre espontáneamente, pero a veces se usan sistemas con mezcla forzada.
de coser.
inyectores
Los inyectores pueden ser universales para introducir muestras de
1 µl a 2 ml o discreto para inyección de muestra de solo un cierto volumen
ema. Ambos tipos de inyectores pueden ser automáticos ("auto-inyectores" o "auto-muestreadores"). El inyector para ingresar la muestra (solución) no se encuentra -
justo antes de la columna cromatográfica. El diseño del inyector permite cambiar la dirección del flujo de PF e introducir preliminarmente una muestra en un circuito de cierto volumen (generalmente de 10 a 100 μl).
Este volumen se indica en la etiqueta del bucle. El diseño del inyector permite la sustitución del bucle. Para introducir la solución analizada en no av-
inyector tomatic utiliza una microjeringa manual con un volumen significativamente
superando con creces el volumen del bucle. El exceso de la solución inyectada, no
en el loop se descarta y se inyecta en la columna el volumen exacto y siempre el mismo de muestra. El llenado manual incompleto del bucle reduce la precisión
precisión y reproducibilidad de la dosificación y, en consecuencia, degrada la precisión
y reproducibilidad del análisis cromatográfico.
columna de cromatografía
Las columnas cromatográficas suelen ser tubos de acero inoxidable, vidrio o plástico llenos de adsorbente y cerrados.
en ambos lados con filtros con un diámetro de poro de 2–5 µm. La duración de la analítica.
columna, dependiendo del mecanismo de separación cromatográfica, puede estar en el rango de 5 a 60 cm o más (usualmente es
10-25 cm), diámetro interior: de 2 a 10 mm (generalmente 4,6 mm). Las columnas con un diámetro interior de menos de 2 mm se utilizan en cromo de microcolumna
tografía También se utilizan columnas capilares con diámetros internos.
ron alrededor de 0,3-0,7 mm. Las columnas para cromatografía preparativa tienen un diámetro interno de hasta 50 mm o más.
Antes de la columna analítica, se pueden instalar cables cortos.
columnas (precolumnas) que realizan diversas funciones auxiliares
(más a menudo - protección de la columna analítica). Por lo general, el análisis se lleva a cabo en
a temperatura ambiente, sin embargo, para aumentar la eficiencia de separación y
acortando la duración del análisis, se puede utilizar un termostato
agotamiento de la columna a temperaturas que no excedan los 60 C. A temperaturas más altas, es posible la degradación del sorbente y un cambio en la composición del PF.
Fase estacionaria (sorbente)
Los adsorbentes comúnmente utilizados son:
1. El gel de sílice, la alúmina y el grafito poroso se utilizan en condiciones normales
cromatografía en fase pequeña. El mecanismo de retención en este caso
té - generalmente adsorción;
2. Resinas o polímeros con grupos ácidos o básicos. Alcance - cromatografía de intercambio iónico;
3. Gel de sílice poroso o polímeros (cromatografía de exclusión por tamaño);
4. Los adsorbentes modificados químicamente (adsorbentes con tejido injertado)
zami), preparado con mayor frecuencia a base de gel de sílice. El mecanismo de retención en la mayoría de los casos es la distribución entre móviles
noah y fases estacionarias;
5. Sorbentes quirales químicamente modificados, por ejemplo,
celulosas acuosas y amilosas, proteínas y péptidos, ciclodextrinas,
se utiliza para separar enantiómeros (cromatografía quiral)
Los adsorbentes de fase ligada pueden tener diversos grados de
modificación descarada. Las partículas absorbentes pueden ser esféricas o no esféricas.
forma regular y porosidad variada.
Las fases ligadas más utilizadas son:
– grupos octilo(sorbente octilsilano o C8);
– grupos octadecilo(sorbente octadecilsilano
(SAO) o C18);
– grupos fenilo(sorbente de fenilsilano);
– grupos cianopropilo(sorbente CN);
– grupos aminopropilo(adsorbente de NH2);
– grupos diol (diol sorbente).
Muy a menudo, el análisis se realiza en fases enlazadas no polares en
modo de fase inversa utilizando sorbente C18.
En algunos casos, es más apropiado utilizar normal
cromatografía de fase. En este caso, se utilizan gel de sílice o fases enlazadas polares ("CN", "NH2", "diol") en combinación con solutos no polares.
Los adsorbentes de fase ligada son químicamente estables a valores de pH de 2,0 a 8,0, a menos que el fabricante especifique lo contrario.
Las partículas absorbentes pueden tener una forma esférica o irregular y una variedad de porosidad. El tamaño de partícula del sorbente en la HPLC analítica suele ser de 3 a 10 µm, en la HPLC preparativa, hasta 50 µm o más.
También se utilizan adsorbentes monolíticos.
La alta eficiencia de separación es proporcionada por el área superficial alta de las partículas adsorbentes (que es una consecuencia de su microscopía).
la presencia de poros), así como la uniformidad de la composición del adsorbente y su empaquetamiento denso y uniforme.
detectores
Se utilizan varios métodos de detección. En el caso general, PF con componentes disueltos en él después de una columna cromatográfica
ki cae en la celda del detector, donde se mide continuamente una u otra de sus propiedades (absorción en la región UV o visible del espectro, fluorescencia,
índice de refracción, conductividad eléctrica, etc.). El cromatograma resultante es un gráfico de la dependencia de algunos
o parámetro físico-químico del PF a tiempo.
Los más comunes son los espectrofotométricos.
detectores (incluida la matriz de diodos), que registran un cambio en la óptica
densidad en el ultravioleta, visible y, a menudo, en el infrarrojo cercano
otras regiones del espectro de 190 a 800 o 900 nm. El cromatograma en este caso
té es la dependencia de la densidad óptica del PF en el tiempo.
El detector espectrofotométrico utilizado tradicionalmente permite
permite la detección en cualquier longitud de onda en su rango de operación
zona. También se utilizan detectores multionda, que permiten realizar
realizar la detección en varias longitudes de onda simultáneamente.
Con la ayuda de un detector de matriz de diodos, es posible no solo llevar a cabo la detección en varias longitudes de onda a la vez, sino también casi instantáneamente.
es posible (sin escanear) obtener el espectro óptico del PF en cualquier momento, lo que simplifica enormemente el análisis cualitativo de los componentes separados
componentes
La sensibilidad de los detectores fluorescentes es aproximadamente 1000 veces mayor que la de los espectrofotométricos. En este caso, se utiliza su propia fluorescencia o la fluorescencia de los derivados correspondientes si el analito en sí no emite fluorescencia. Moderno
Los detectores fluorescentes intercambiables hacen posible no sólo obtener cromato-
gramos, sino también para registrar los espectros de excitación y fluorescencia del análisis
conexiones viables.
Los detectores refractométricos se utilizan para analizar muestras que no absorben en las regiones UV y visible del espectro (por ejemplo, carbohidratos).
(refractómetros). Las desventajas de estos detectores son su baja sensibilidad (en comparación con los detectores espectrofotométricos) y la significativa dependencia de la temperatura de la intensidad de la señal (el detector debe estar termostatizado).
También se utilizan detectores electroquímicos (conductimétricos).
cielo, amperométrica, etc.), espectrometría de masas y Fourier-IR
detectores, detectores de dispersión de luz, radiactividad y algunos otros
fase móvil
EN Una variedad de solventes, tanto individuales como sus mezclas, pueden usarse como PF.
EN fase normal La cromatografía suele utilizar carbón líquido.
hidrocarburos (hexano, ciclohexano, heptano) y otros relativamente no polares
disolventes con pequeñas adiciones de compuestos orgánicos polares,
que regulan la fuerza de elución del PF.
En la cromatografía de fase reversa, la composición del PF incluye polar or-
disolventes orgánicos (normalmente acetonitrilo y metanol) y agua. para opti-
Los estudios de separación a menudo usan soluciones acuosas con un cierto signo
Valor de pH, en particular soluciones tampón. Se utilizan aditivos inorgánicos.
ácidos cálicos y orgánicos, bases y sales y otros compuestos (sobre
ejemplo, modificadores quirales para separar enantiómeros en aquiral-
nom sorbente).
El control del valor de pH debe realizarse por separado para el componente acuoso, y no para su mezcla con un disolvente orgánico.
PF puede consistir en un solvente, a menudo dos, si es necesario
dimity - de tres o más. La composición de PF se indica como la relación de volumen de sus disolventes constituyentes. En algunos casos, la masa
proporción, que deberá ser estipulada especialmente.
Cuando se utiliza un detector espectrofotométrico UV, el PF no debe tener una absorción pronunciada en la longitud de onda elegida para la detección. El límite de transparencia o densidad óptica al determinar
la longitud de onda especificada del solvente de un fabricante en particular a menudo se indica
está en el paquete.
El análisis cromatográfico está muy influenciado por el grado de pureza del PF, por lo que es preferible utilizar disolventes producidos
nye específicamente para cromatografía líquida (incluyendo agua).
El PF y las soluciones analizadas no deben contener
partículas y burbujas de gas. Agua obtenida en el laboratorio
soluciones acuosas premezcladas con agua disolventes orgánicos
Los disolventes, así como las soluciones analizadas, deben someterse a filtración fina y desgasificación. El filtrado se suele utilizar para este propósito.
al vacío a través de un filtro de membrana inerte con respecto a este disolvente o solución con un tamaño de poro de 0,45 μm.
Sistema de recopilación y procesamiento de datos.
Un sistema moderno de procesamiento de datos es un sistema conjugado
computadora personal conectada con el cromatógrafo con software instalado
software que le permite registrar y procesar crono-
matograma, así como administrar el funcionamiento del cromatógrafo y monitorear los principales
mi parámetros del sistema cromatográfico.
Lista de condiciones cromatográficas a especificar
En una monografía privada, las dimensiones de la co-
columnas, tipo de sorbente con indicación del tamaño de partícula, temperatura de la columna (si es necesario controlar la temperatura), volumen de muestra inyectada (volumen del circuito),
Estado de PF y método de preparación, tasa de alimentación de PF, detector y condiciones de detección, descripción del modo de gradiente (si se usa), tiempo de cromatografía.
INTERCAMBIO IÓNICO Y HPLC IÓNICO
La cromatografía de intercambio iónico se utiliza para el análisis como un orgánico
skikh (bases heterocíclicas, aminoácidos, proteínas, etc.), y no o
compuestos gánicos (varios cationes y aniones). Separación de componentes
componentes de la mezcla analizada en cromatografía de intercambio iónico se basa en la interacción reversible de los iones de las sustancias analizadas con grupos iónicos.
sorbente pami. Los intercambiadores de aniones o intercambiadores de cationes se utilizan como adsorbentes.
usted. Estos adsorbentes son principalmente ion-poliméricos
resinas de intercambio (generalmente copolímeros de estireno y divinilbenceno con injerto
grupos iónicos), o geles de sílice con grupos de intercambio iónico injertados. Los adsorbentes con grupos -(CH2)3 N+ X– se utilizan para separar aniones, y los adsorbentes con grupos -(CH2)SO3 – H+ se utilizan para separar cationes.
Por lo general, las resinas poliméricas se utilizan para separar aniones y para separar e-
Los cationes son geles de sílice modificados.
Como PF en la cromatografía de intercambio iónico, se utilizan soluciones acuosas de ácidos, bases y sales. Normalmente se utilizan carreras de búfer
soluciones que le permiten mantener ciertos valores de pH. También es posible utilizar pequeños aditivos orgánicos miscibles en agua.
solventes cal - acetonitrilo, metanol, etanol, tetrahidrofurano.
cromatografía iónica- una variante de la cromatografía de intercambio iónico, en
que, para determinar la concentración de iones del analito, se utiliza
utilizando un detector conductimétrico. Para operaciones altamente sensibles
Para determinar los cambios en la conductividad eléctrica que pasa por el detector de FP, la conductividad eléctrica de fondo del FP debe ser baja.
Hay dos variantes principales de la cromatografía iónica.
El primero de ellos se basa en la supresión de la conductividad eléctrica del electrolítico.
ese PF usando la segunda columna de intercambio iónico ubicada entre el anal-
columna lítica y detector. En esta columna tiene lugar la neutralización.
PF y los compuestos analizados ingresan a la celda detectora en desionización
agua zirovannoy. Los iones detectados son los únicos iones
asegurando la conductividad del PF. La desventaja de la columna supresora es la necesidad de su regeneración a intervalos bastante cortos.
me. La columna de supresión se puede sustituir por una columna de funcionamiento continuo
supresor de membrana, en el que la composición de la membrana es continuamente
es el flujo de solución regeneradora moviéndose en la dirección
opuesta a la dirección del flujo de PF.
La segunda versión de la cromatografía iónica es la cromatografía iónica de columna única.
matografía En esta variante se utiliza un PF de muy baja conductividad eléctrica.
contenido de agua. Los compuestos orgánicos débiles son ampliamente utilizados como electrolitos.
ácidos del cielo - benzoico, salicílico o isoftálico.
TAMAÑO HPLC
La cromatografía de exclusión por tamaño (cromatografía en gel) es una versión especial de HPLC basada en la separación de moléculas según su tamaño. Distribución
moléculas entre las fases estacionaria y móvil se basa en el tamaño del mo-
moléculas y en parte de su forma y polaridad. Para la separación, utilice
absorbentes porosos: polímeros, gel de sílice, vidrios porosos y polisacáridos.
El tamaño de partícula de los adsorbentes es de 5 a 10 µm.
Las ventajas de los vidrios porosos y el gel de sílice son la rápida difusión de PF y las moléculas de analito en los poros, la estabilidad en diversas condiciones (incluso a altas temperaturas). Sorbeno polimérico
son copolímeros de estireno y divinilbenceno (este es un hidro-
absorbentes fóbicos utilizados con fases móviles no polares) y
geles hidrófilos obtenidos a partir de resinas de poliacrilamida o divinilbenceno sulfonadas.
Son posibles dos tipos limitantes de interacción de moléculas con una fase estacionaria porosa. Las moléculas más grandes que el diámetro medio de un poro no penetran en absoluto en el adsorbente y se eluyen junto con la fase móvil.
zoy primero. Moléculas con un diámetro mucho más pequeño que el tamaño de poro del tipo
las curvas penetran libremente en él, permanecen en la fase estacionaria durante más tiempo y se eluyen en último lugar. Moléculas de tamaño mediano penetran en los poros del adsorbente dependiendo de su tamaño y parcialmente dependiendo de su forma. Eluyen con diferentes tiempos de retención entre
nuestras moléculas más grandes y más pequeñas. La separación de los componentes de la muestra cromatográfica se produce como resultado de ac-
la difusión de los componentes de la muestra en los poros del sorbente, y viceversa.
En la cromatografía de exclusión por tamaño, para caracterizar la retención,
se utiliza un volumen de retención igual al producto del caudal de PF y el tiempo de retención.
fase móvil. La elección del PF depende del tipo de adsorbente. Exclusión-
la cromatografía generalmente se divide en filtración en gel y cromatografía en gel.
cromatografía de permeación.
El método de cromatografía de filtración en gel se utiliza para separar
de compuestos solubles en agua sobre adsorbentes hidrofílicos. Las fases móviles son soluciones tampón acuosas con un valor de pH dado.
La cromatografía de permeación en gel utiliza hidrofóbico
compuestos y disolventes orgánicos no polares (tolueno, diclorometano, tetra-
hidrofurano). Este método se utiliza para analizar compuestos que son ligeramente solubles.
bordeado en agua.
detectores Como detectores en la cromatografía de exclusión por tamaño, se utilizan detectores refractométricos diferenciales, así como detectores espectrofotométricos (incluidos los de la región IR del espectro).
También se utilizan detectores láser viscométricos y de flujo.
Estos detectores, en combinación con un refractómetro u otra concentración
detector le permite determinar continuamente el peso molecular de
limador en PF.
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ULTRA RENDIMIENTO
La cromatografía líquida de ultra rendimiento es una variante de la cromatografía líquida que es más eficiente
stu en comparación con HPLC clásica.
Una característica de la cromatografía líquida de ultra rendimiento es
el uso de adsorbentes con un tamaño de partícula de 1,5 a 2 micras. Cro-
columnas matográficas son por lo general de 50 a 150 mm de longitud y 1
hasta 4 mm de diámetro. El volumen de la muestra inyectada puede ser de 1 a 50 µl.
Equipo cromatográfico utilizado en la clásica.
riante HPLC, normalmente especialmente adaptado para este tipo de cromatografía
Los equipos diseñados para cromatografía líquida de ultra rendimiento también se pueden utilizar en la versión clásica de HPLC.
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La HPLC es una cromatografía en columna líquida, en la que se pueden utilizar una variedad de mecanismos de sorción. Esencialmente, HPLC es una forma moderna de cromatografía en columna líquida clásica. A continuación se enumeran algunas de las características cualitativas más significativas de HPFA:
- alta velocidad del proceso, que permitió reducir la duración de la separación de varias horas y días a minutos;
- el grado mínimo de borrosidad de las zonas cromatográficas, que permite separar compuestos que difieren solo ligeramente en las constantes de sorción;
- un alto grado de mecanización y automatización de la separación y el procesamiento de la información, gracias al cual la cromatografía líquida en columna ha alcanzado un nuevo nivel de reproducibilidad y precisión.
Estudios intensivos de las últimas décadas, una gran cantidad de datos experimentales acumulados permiten hoy hablar sobre la clasificación de variantes en el marco del método de cromatografía líquida de alto rendimiento. Por supuesto, en este caso, la clasificación según el mecanismo de sorción dada anteriormente sigue siendo válida.
Una clasificación común se basa en la polaridad comparativa de las fases móvil y estacionaria. Se hace una distinción entre cromatografía de fase normal y reversa.
La cromatografía en fase normal (NPC) es una variante de HPLC cuando la fase móvil es menos polar que la fase estacionaria, y hay razones para creer que el factor principal que determina la retención es la interacción de los sorbatos directamente con la superficie o el volumen del adsorbente. .
La cromatografía de fase inversa (RPC) es una variante de la HPLC cuando la fase móvil es más polar que la estacionaria y la retención está determinada por el contacto directo de las moléculas de sorbato con la superficie o volumen del adsorbente; en este caso, los sorbatos ionizados no se intercambian por iones de la fase móvil adsorbidos en la superficie.
Cromatografía de intercambio iónico: una variante en la que la sorción se lleva a cabo mediante el intercambio de iones absorbidos de la fase móvil por iones de sustancias cromatográficas; la cromatografía de intercambio de ligando se puede determinar exactamente de la misma manera.
La cromatografía en sorbentes modificados dinámicamente es una variante de HPLC, en la que el sorbato no interactúa directamente con la superficie del sorbente, sino que entra en asociación con las moléculas de las capas cercanas a la superficie del eluyente.
La cromatografía de pares de iones es una variante de la cromatografía de fase inversa de compuestos ionizados, en la que se agrega un contraión hidrofóbico a la fase móvil, lo que cambia cualitativamente las características de sorción del sistema.
La cromatografía de exclusión por tamaño es un método para separar compuestos por sus pesos moleculares, basado en la diferencia en la tasa de difusión en los poros de la fase estacionaria de moléculas de varios tamaños.
Para HPFA, una característica muy importante es el tamaño de los adsorbentes, generalmente de 3 a 5 µm, ahora hasta 1,8 µm. Esto permite separar mezclas complejas de sustancias de forma rápida y completa (el tiempo medio de análisis es de 3 a 30 min).
El problema de la separación se resuelve utilizando una columna cromatográfica, que es un tubo lleno de un adsorbente. Al realizar un análisis, se alimenta un líquido (eluyente) de cierta composición a través de una columna cromatográfica a una velocidad constante. En esta corriente se inyecta una dosis de muestra medida con precisión. Los componentes de la muestra introducidos en la columna cromatográfica, debido a su diferente afinidad con el sorbente de la columna, se desplazan a lo largo de ésta a distintas velocidades y llegan al detector secuencialmente en distintos momentos.
Así, la columna cromatográfica es responsable de la selectividad y eficiencia de separación de los componentes. Al seleccionar diferentes tipos de columnas, puede controlar el grado de separación de las sustancias analizadas. Los compuestos se identifican por su tiempo de retención. La determinación cuantitativa de cada uno de los componentes se calcula en base a la magnitud de la señal analítica medida mediante un detector conectado a la salida de la columna cromatográfica.
Sorbentes. El desarrollo de HPLC está asociado en gran medida con la creación de nuevas generaciones de sorbentes con buenas propiedades cinéticas y varias propiedades termodinámicas. El material principal para los adsorbentes en HPLC es el gel de sílice. Es mecánicamente fuerte y tiene una porosidad significativa, lo que le otorga una gran capacidad de intercambio para tamaños de columna pequeños. El tamaño de partícula más común es de 5 a 10 micrones. Cuanto más se acerque a la forma esférica de las partículas, menor será la resistencia al flujo, mayor será la eficiencia, especialmente si se filtra una fracción muy estrecha (por ejemplo, 7 +1 micras).
El área de superficie específica del gel de sílice es de 10-600 m/g. El gel de sílice se puede modificar con varios grupos químicos injertados en la superficie (C-18, CN, NH2, SO3H), lo que hace posible usar adsorbentes basados en él para separar varias clases de compuestos. La principal desventaja del gel de sílice es su baja resistencia química a pH< 2 и рН >9 (el sílice se disuelve en álcalis y ácidos). Por ello, actualmente se está realizando una intensa búsqueda de sorbentes basados en polímeros que sean estables a pH de 1 a 14, por ejemplo, a base de polimetilmetacrilato, poliestireno, etc.
Sorbentes para cromatografía de intercambio iónico. Debido a las peculiaridades de separación (en medio ácido o alcalino), el material principal es sorbente a poliestireno con divinilbenceno de varios grados de reticulación con grupos SO3 -H + injertados en su superficie (intercambiadores de cationes fuertemente ácidos) o -COO -Naf (intercambiadores de cationes débilmente ácidos), -H2N + (CH3) 3Cl- (intercambiadores de aniones de base fuerte) o -N+HR2Cl- (intercambiadores de aniones de base débil).
Sorbentes para cromatografía de penetración en gel. El tipo principal es estireno-DVB. También se utilizan vidrios macroporosos, metacrilato de metilo, gel de sílice. Para la cromatografía de exclusión iónica, se utilizan los mismos adsorbentes.
Zapatillas. Para asegurar el flujo de la fase móvil (MP) a través de la columna con los parámetros especificados, se utilizan bombas de alta presión. Las especificaciones más importantes para las bombas LC son: rango de flujo; presión máxima de trabajo; reproducibilidad del flujo; rango de pulsaciones de suministro de disolvente.
Por la naturaleza del suministro de solvente, las bombas pueden ser de suministro constante (caudal) y presión constante. Básicamente, en el trabajo analítico, se usa un modo de flujo constante, cuando se llenan columnas, se usa un modo de presión constante. Según el principio de funcionamiento, las bombas se dividen en bombas de jeringa y bombas de émbolo alternativo.
bombas de jeringa Las bombas de este tipo se caracterizan por la ausencia casi total de pulsaciones en el flujo de la fase móvil durante el funcionamiento. Desventajas de la bomba: a) alto consumo de tiempo y solvente para el lavado al cambiar el solvente; b) suspensión de la separación durante el llenado de la bomba; c) grandes dimensiones y peso al mismo tiempo que proporciona un alto caudal y presión (se necesita un motor potente y un pistón de gran fuerza con su gran área).
Bombas alternativas de émbolo. Las bombas de este tipo proporcionan un caudal volumétrico constante de la fase móvil durante mucho tiempo. Presión máxima de trabajo 300-500 atm, caudal 0,01-10 ml/min. Reproducibilidad de la alimentación volumétrica - 0,5%. El principal inconveniente es que el disolvente se alimenta al sistema en forma de una serie de pulsos sucesivos, por lo que hay pulsaciones de presión y flujo.
Esta es la razón principal del aumento del ruido y la desensibilización de casi todos los detectores utilizados en LC, especialmente los electroquímicos. Formas de combatir las pulsaciones: usando bombas dobles o una bomba Bag-lai de dos émbolos, usando dispositivos de amortiguación y dispositivos electrónicos.
La cantidad de alimentación volumétrica está determinada por tres parámetros: diámetro del émbolo (generalmente 3,13; 5,0; 7,0 mm), su amplitud (12-18 mm) y frecuencia (que depende de la velocidad de rotación del motor y la caja de cambios).
Dosificadores. El propósito del dosificador es transferir una muestra a presión atmosférica a la entrada de una columna a presiones de hasta varias atmósferas. Es importante que el dispensador esté libre de volúmenes "muertos" que no puedan ser lavados por la fase móvil y que la muestra no se lave durante la dispensación. Al principio, los dispensadores en LC eran similares a los dispensadores de gas con una membrana perforada. Sin embargo, las membranas no aguantan más de 50-100 atm, su resistencia química es insuficiente, sus piezas contaminan los filtros de la columna y los capilares.
En la fase líquida, la velocidad de difusión es mucho menor que en la fase gaseosa. Por lo tanto, es posible prescindir de una parada de flujo: la muestra no tiene tiempo de desdibujarse en el dispensador. Durante la inyección de la muestra en el dispensador, un grifo especial cierra el flujo del solvente. La presión a la entrada de la columna disminuye rápidamente, después de unos segundos la muestra se puede inyectar en la cámara de dosificación con una microjeringa convencional. A continuación, se bloquea el dispensador, se activa el flujo de disolvente y tiene lugar la separación.
La presión que soporta esta válvula es de hasta 500-800 atm. Pero cuando el flujo se detiene, se altera el equilibrio en la columna, lo que puede provocar la aparición de picos adicionales "vacíos".
Los dispensadores de bucle son los más utilizados. Cuando se llena el dispensador a alta presión, hay entradas 1, 2 y un canal entre ellas. Las entradas 3-6, los canales entre ellas y el circuito de dosificación están a presión atmosférica, lo que le permite llenar el circuito con una jeringa o bomba. A medida que gira el dispensador, el flujo de la fase móvil empuja la muestra hacia la columna. Para reducir el error, el bucle se lava con 5 a 10 veces el volumen de la muestra. Si la muestra es pequeña, puede inyectarse en el asa con una microjeringa. El volumen del bucle suele ser de 5 a 50 μl.
SOBRE EL. Voinov, T. G. Volova
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un método de cromatografía en columna en el que la fase móvil (MP) es un líquido que se mueve a través de una columna cromatográfica llena de una fase estacionaria (sorbente). Las columnas de HPLC se caracterizan por una alta presión hidráulica en la entrada de la columna, por lo que a veces se hace referencia a la HPLC como "cromatografía líquida de alta presión".
Según el mecanismo de separación de sustancias, se distinguen las siguientes variantes de HPLC: adsorción, distribución, intercambio iónico, exclusión, quiral, etc.
En la cromatografía de adsorción, la separación de sustancias ocurre debido a su diferente capacidad para ser adsorbidas y desorbidas de la superficie de un adsorbente con una superficie desarrollada, por ejemplo, gel de sílice.
En HPLC de partición, la separación se produce debido a la diferencia en los coeficientes de distribución de las sustancias a separar entre las fases estacionaria (por lo general, químicamente injertadas en la superficie de un soporte estacionario) y móvil.
Por polaridad, PF y NF HPLC se dividen en fase normal y fase inversa.
La cromatografía de fase normal es una variante de la cromatografía que utiliza un sorbente polar (por ejemplo, gel de sílice o gel de sílice con grupos NH 2 o CN injertados) y PF no polar (por ejemplo, hexano con varios aditivos). En la cromatografía de fase inversa, se utilizan absorbentes modificados químicamente no polares (p. ej., radical alquilo C18 no polar) y fases móviles polares (p. ej., metanol, acetonitrilo).
En la cromatografía de intercambio iónico, las moléculas de las sustancias de la mezcla, disociadas en solución en cationes y aniones, se separan al moverse a través del adsorbente (intercambiador catiónico o intercambiador de aniones) debido a sus diferentes tasas de intercambio con los grupos iónicos del adsorbente. .
En la cromatografía de exclusión por tamaño (tamiz, penetración en gel, filtración en gel), las moléculas de las sustancias se separan por tamaño debido a su diferente capacidad para penetrar en los poros de la fase estacionaria. En este caso, las moléculas más grandes (con mayor peso molecular) capaces de penetrar en el mínimo número de poros de la fase estacionaria son las primeras en salir de la columna, y las sustancias de pequeño tamaño molecular son las últimas en salir.
a menudo la separación procede no por uno, sino por varios mecanismos simultáneamente.
El método HPLC se puede utilizar para el control de calidad de cualquier analito no gaseoso. Para el análisis, se utilizan instrumentos apropiados: cromatógrafos líquidos.
La composición de un cromatógrafo de líquidos suele incluir los siguientes componentes principales:
– una unidad de preparación de FP, que incluye un tanque con una fase móvil (o tanques con solventes individuales que forman parte de la fase móvil) y un sistema de desgasificación de FP;
– sistema de bombeo;
– mezclador de fase móvil (si es necesario);
– sistema de inyección de muestra (inyector);
– columna cromatográfica (se puede instalar en un termostato);
– detector;
– sistema de recopilación y procesamiento de datos.
Sistema de bombeo
Las bombas suministran el PF a la columna a una tasa constante dada. La composición de la fase móvil puede ser constante o cambiar durante el análisis. En el primer caso, el proceso se llama isocrático, y en el segundo, gradiente. A veces se instalan filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm antes del sistema de bombeo para filtrar la fase móvil. Un sistema de bombeo de cromatografía de líquidos moderno consta de una o más bombas controladas por computadora. Esto le permite cambiar la composición del PF según un programa específico durante la elución en gradiente. La mezcla de componentes PF en el mezclador puede ocurrir tanto a baja presión (antes de las bombas) como a alta presión (después de las bombas). El mezclador se puede utilizar para la preparación de PF y para la elución isocrática; sin embargo, se logra una relación de componentes más precisa mezclando previamente los componentes de PF para el proceso isocrático. Las bombas HPLC analíticas permiten mantener un caudal constante de PF en la columna en el rango de 0,1 a 10 ml/min a una presión de entrada de columna de hasta 50 MPa. Sin embargo, es aconsejable que este valor no supere los 20 MPa. Las pulsaciones de presión se minimizan mediante sistemas amortiguadores especiales incluidos en el diseño de las bombas. Las partes de trabajo de las bombas están hechas de materiales resistentes a la corrosión, lo que permite el uso de componentes agresivos en la composición del PF.
(principalmente intermolecular) en la interfase. Como método de análisis, la HPLC forma parte de un grupo de métodos que, debido a la complejidad de los objetos en estudio, incluye la separación preliminar de la mezcla compleja inicial en otras relativamente simples. Las mezclas simples obtenidas se analizan luego por métodos fisicoquímicos convencionales o por métodos especiales desarrollados para la cromatografía.
El método HPLC se usa ampliamente en campos como la química, la petroquímica, la biología, la biotecnología, la medicina, el procesamiento de alimentos, la protección del medio ambiente, la producción de medicamentos y muchos otros.
Según el mecanismo de separación de las sustancias analizadas o separadas, la HPLC se divide en adsorción, distribución, intercambio iónico, exclusión, intercambio de ligandos y otros.
Debe tenerse en cuenta que en el trabajo práctico, la separación a menudo se produce no por uno, sino por varios mecanismos simultáneamente. Por lo tanto, la separación por exclusión puede complicarse por los efectos de adsorción, adsorción - distribución y viceversa. Al mismo tiempo, cuanto mayor sea la diferencia de sustancias en la muestra en términos de grado de ionización, basicidad o acidez, en términos de peso molecular, polarizabilidad y otros parámetros, más probable es que aparezca un mecanismo de separación diferente. para tales sustancias.
HPLC en fase normal
La fase estacionaria es más polar que la fase móvil, por lo que el disolvente no polar predomina en la composición del eluyente:
- Hexano:isopropanol = 95:5 (para sustancias poco polares)
- Cloroformo:metanol = 95:5 (para sustancias polares medias)
- Cloroformo:metanol = 80:20 (para sustancias altamente polares)
HPLC de fase inversa
La fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, por lo que casi siempre hay agua en el eluyente. En este caso, siempre es posible asegurar la disolución completa del BAS en la fase móvil, casi siempre es posible usar la detección UV, casi todas las fases móviles son miscibles entre sí, se puede usar elución en gradiente, la columna se puede volver a cambiar rápidamente -equilibrada, la columna se puede regenerar.
Los eluyentes comunes para HPLC de fase inversa son:
- Acetonitrilo: agua
- metanol: agua
- Isopropanol: agua
Matrices para HPLC
Las matrices utilizadas en HPLC son compuestos inorgánicos como sílice (gel de sílice) o alúmina, o polímeros orgánicos como poliestireno (reticulado con divinilbenceno) o polimetacrilato. El gel de sílice es, por supuesto, ahora generalmente aceptado.
Las principales características de la matriz:
- Tamaño de partícula (µm);
- Tamaño de poro interno (Å, nm).
Obtención de gel de sílice para HPLC:
- Formación de microesferas de ácido polisilícico;
- Secado de partículas de gel de sílice;
- Separación de aire.
Partículas absorbentes:
- Regular (esférica): mayor resistencia a la presión, mayor costo;
- No esférica: menor resistencia a la presión.
El tamaño de poro en HPLC es uno de los parámetros más importantes. Cuanto menor sea el tamaño de los poros, peor será su permeabilidad para las moléculas de las sustancias eluidas. Y en consecuencia, peor será la capacidad de sorción de los adsorbentes. Cuanto más grandes son los poros, menor es, en primer lugar, la estabilidad mecánica de las partículas adsorbentes y, en segundo lugar, cuanto menor es la superficie de sorción, por lo tanto, peor es la eficiencia.
Injertos de fase estacionaria
HPLC en fase normal:
- Fase estacionaria injertada con propilnitrilo (nitrilo);
- Fase estacionaria con injerto de propilamina (amina).
HPLC de fase inversa:
- Fase estacionaria con injerto de alquilo;
- Fase estacionaria con injerto de alquilsililo.
Recubrimiento final: protección de áreas no injertadas del sorbente mediante injertos adicionales con moléculas "pequeñas". Protección terminal hidrofóbica (C1, C2): mayor selectividad, peor humectabilidad; protección terminal hidrófila (diol): menor selectividad, mayor humectabilidad.
detectores de HPLC
- ultravioleta
- matriz de diodos
- Fluorescente
- electroquímico
- refractométrico
- selectivo de masas
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Cromatografía de adsorción de líquidos en columna
La separación de una mezcla de sustancias en una columna de adsorción se produce como resultado de su diferencia de capacidad de absorción en un adsorbente dado (de acuerdo con la ley de sustitución de adsorción establecida por M. S. Tsvet).
Los adsorbentes son cuerpos porosos con una superficie interna muy desarrollada que retienen líquidos a través de fenómenos intermoleculares y superficiales. Estos pueden ser compuestos inorgánicos y orgánicos polares y no polares. Los adsorbentes polares incluyen gel de sílice (dióxido de silicio gelatinoso seco), óxido de aluminio, carbonato de calcio, celulosa, almidón, etc. Adsorbentes no polares: carbón activado, polvo de caucho y muchos otros obtenidos sintéticamente.
Los adsorbentes están sujetos a los siguientes requisitos: S no deben entrar en reacciones químicas con la fase móvil y las sustancias a separar; S debe tener resistencia mecánica; Los granos S del adsorbente deben tener el mismo grado de dispersión.
Al elegir las condiciones para el proceso cromatográfico, se tienen en cuenta las propiedades del adsorbente y las sustancias adsorbidas.
En la versión clásica de la cromatografía en columna líquida (LCC), se pasa un eluyente (PF) a través de una columna cromatográfica, que es un tubo de vidrio de 0,5 a 5 cm de diámetro y 20 a 100 cm de largo, lleno de un adsorbente (NP). El eluyente se mueve bajo la influencia de la gravedad. La velocidad de su movimiento se puede ajustar mediante la grúa en la parte inferior de la columna. La mezcla a analizar se coloca en la parte superior de la columna. A medida que la muestra se mueve a través de la columna, los componentes se separan. A determinados intervalos se toman fracciones del eluyente liberado de la columna, las cuales son analizadas por cualquier método que permita medir las concentraciones de analitos.
La cromatografía de adsorción en columna se usa actualmente principalmente no como un método de análisis independiente, sino como un método de separación preliminar (a veces final) de mezclas complejas en otras más simples, es decir, prepararse para el análisis por otros métodos (incluido el cromatográfico). Por ejemplo, se separa una mezcla de tocoferoles en una columna de alúmina, se pasa el eluyente y se recoge la fracción de α-tocoferoles para su posterior determinación fotométrica.
La separación cromatográfica de la mezcla en la columna debido al lento avance del PF lleva mucho tiempo. Para acelerar el proceso, la cromatografía se realiza bajo presión. Este método se llama Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
La modernización del equipo utilizado en la cromatografía en columna líquida clásica lo ha convertido en uno de los métodos de análisis más prometedores y modernos. La cromatografía líquida de alta resolución es un método conveniente para la separación, el aislamiento preparativo y el análisis cualitativo y cuantitativo de compuestos termolábiles no volátiles de bajo y alto peso molecular.
Dependiendo del tipo de sorbente utilizado, este método utiliza 2 opciones de cromatografía: en un sorbente polar que usa un eluyente no polar (opción de fase directa) y en un sorbente no polar que usa un eluyente polar, el llamado de fase inversa alta. -cromatografía líquida de alto rendimiento (RP HPLC).
Cuando el eluyente pasa al eluyente, el equilibrio en condiciones de RPHLC se establece muchas veces más rápido que en las condiciones de adsorbentes polares y PF no acuosos. Como resultado de esto, además de la conveniencia de trabajar con agua y eluyentes hidroalcohólicos, RPHLC ahora ha ganado gran popularidad. La mayoría de los análisis de HPLC se llevan a cabo utilizando este método.
Instrumentación para HPLC
Un conjunto de equipos modernos para HPLC, por regla general, consta de dos bombas 3,4 (Fig. 7.1.1.1), controladas por un microprocesador 5 y que suministran eluyente de acuerdo con un programa específico. Las bombas crean una presión de hasta 40 MPa. La muestra se inyecta a través de un dispositivo especial (inyector) 7 directamente en el flujo de eluyente. Después de pasar por la columna cromatográfica 8, las sustancias son detectadas por un detector de flujo altamente sensible 9, cuya señal es registrada y procesada por el microordenador 11. Si es necesario, las fracciones se seleccionan automáticamente en el momento de la salida máxima.
Las columnas para HPLC están hechas de acero inoxidable con un diámetro interior de 2 a 6 mm y una longitud de 10 a 25 cm Las columnas se llenan con un adsorbente (NF). Como NF se utilizan gel de sílice, alúmina o adsorbentes modificados. El gel de sílice generalmente se modifica mediante la introducción química de varios grupos funcionales en su superficie.
detectores El registro de la salida de la columna de un componente separado se realiza mediante un detector. Para el registro, puede utilizar el cambio en cualquier señal analítica proveniente de la fase móvil y relacionada con la naturaleza y cantidad del componente de la mezcla. La cromatografía líquida utiliza señales analíticas como la absorción de luz o la emisión de luz de la solución que sale (detectores fotométricos y fluorimétricos), índice de refracción (detectores refractométricos), conductividad eléctrica y potencial (detectores electroquímicos), etc.
La señal detectada continuamente es registrada por el registrador. Un cromatograma es una secuencia de señales de detector registradas en una grabadora, que se generan cuando los componentes individuales de una mezcla salen de la columna. En el caso de separación de la mezcla, los picos separados son visibles en el cromatograma externo. La posición del pico en el cromatograma se utiliza con fines de identificación de la sustancia, la altura o el área del pico se utiliza con fines de determinación cuantitativa.
Analisis cualitativo
Las características más importantes del cromatograma - el tiempo de retención tR y el volumen de retención asociado al mismo - reflejan la naturaleza de las sustancias, su capacidad de sorción sobre el material de la fase estacionaria y, por tanto, en condiciones cromatográficas constantes, son un medios para identificar la sustancia. Para una columna determinada con un caudal y una temperatura determinados, el tiempo de retención de cada compuesto es constante (Fig. 7.1.1.2), donde tR(A) es el tiempo de retención del componente A de la mezcla analizada desde que se inyecta en la columna hasta que aparezca el pico máximo a la salida de la columna, 1K( ss) - tiempo de retención del patrón interno (sustancia inicialmente ausente en la mezcla analizada), h - altura del pico (mm), ab - anchura del pico a la mitad de su altura , mm.
Para identificar una sustancia por cromatograma, se suelen utilizar muestras estándar o sustancias puras. Compare el tiempo de retención del componente IR* desconocido con el tiempo de retención IRCT de las sustancias conocidas. Pero una identificación más confiable al medir el tiempo de retención relativo
En este caso, primero se introduce una sustancia conocida (estándar interno) en la columna y se mide su tiempo de retención tR(Bc), luego la mezcla de prueba se separa cromatográficamente (cromatografía), a la que se le agrega preliminarmente el estándar interno. El tiempo de retención relativo está determinado por la fórmula (7.1.1.1).
Análisis cuantitativo
Este análisis se basa en la dependencia de la altura del pico ho su área S de la cantidad de sustancia. Para picos estrechos, es preferible medir h, para picos anchos y borrosos - S. El área del pico se mide de diferentes maneras: multiplicando la altura del pico (h) por su ancho (ai / 2), medido a la mitad de su altura (Fig. 7.2.3); planificación; utilizando un integrador. Los cromatógrafos modernos están equipados con integradores eléctricos o electrónicos.
Se utilizan principalmente tres métodos para determinar el contenido de sustancias en una muestra: el método de calibración absoluta, el método de normalización interna y el método de patrón interno.
El método de calibración absoluta se basa en una determinación preliminar de la relación entre la cantidad de sustancia introducida y el área o altura del pico en el cromatograma. Se introduce una cantidad conocida de la mezcla de calibración en el cromatograma y se determinan las áreas o alturas de los picos resultantes. Construya un gráfico del área o la altura del pico a partir de la cantidad de sustancia inyectada. Se analiza la muestra de prueba, se mide el área o altura del pico del componente determinado y se calcula su cantidad en base a la curva de calibración.
Este método proporciona información solo sobre el contenido relativo del componente en la mezcla, pero no permite determinar su valor absoluto.
El método del estándar interno se basa en la comparación de un parámetro de pico seleccionado de un analito con el mismo parámetro de una sustancia estándar introducida en la muestra en una cantidad conocida. Se introduce una cantidad conocida de dicha sustancia estándar en la muestra de prueba, cuyo pico está suficientemente bien separado de los picos de los componentes de la mezcla de prueba.
Los dos últimos métodos requieren la introducción de factores de corrección que caractericen la sensibilidad de los detectores utilizados a las sustancias analizadas. Para diferentes tipos de detectores y diferentes sustancias, el coeficiente de sensibilidad se determina experimentalmente.
La cromatografía de adsorción de líquidos también utiliza el análisis de fracciones de soluciones recolectadas en el momento en que la sustancia sale de la columna. El análisis puede llevarse a cabo por varios métodos fisicoquímicos.
La cromatografía de adsorción de líquidos se utiliza principalmente para la separación de sustancias orgánicas. Este método tiene mucho éxito en el estudio de la composición del aceite, los hidrocarburos, la separación efectiva de isómeros trans y cis, alcaloides, etc. La HPLC se puede utilizar para determinar tintes, ácidos orgánicos, aminoácidos, azúcares, impurezas de pesticidas y herbicidas, sustancias medicinales. y otros contaminantes en los productos alimenticios.