Técnica de dibujos por cromatografía en papel. Cromatografía sobre papel (PC). Técnicas de separación cromatográfica.

Método de cromatografía en papel Hace referencia a la cromatografía plana, se basa en la distribución de analitos entre dos líquidos inmiscibles.

En la cromatografía de partición, la separación de sustancias se produce debido a diferencias en los coeficientes de distribución de componentes entre dos líquidos inmiscibles. La sustancia está presente en ambas fases como solución. La fase estacionaria se retiene en los poros del papel cromatográfico sin interactuar con él; el papel actúa como portador de la fase estacionaria.

Tipos de papel de cromatografía:

el papel hidrofílico retiene hasta un 22% de agua en sus poros; fase estacionaria – agua, fase móvil – disolvente orgánico; Este papel se utiliza para determinar sustancias solubles en agua.

el papel hidrófobo repele el agua, por lo que se impregna con un disolvente orgánico apolar (fase estacionaria); la fase móvil es agua; Este documento se utiliza para determinar compuestos insolubles en agua (ácidos liposolubles, vitaminas).

Los siguientes requisitos se aplican al papel cromatográfico:

pureza química;

neutralidad química y de adsorción con respecto a las sustancias analizadas y la fase móvil;

uniformidad en densidad;

misma dirección de las fibras.

Para obtener un cromatograma se coloca sobre un papel una gota de la mezcla que se analiza. El papel se coloca en la cámara cromatográfica, su extremo se sumerge en un recipiente con el eluyente. El disolvente se mueve a lo largo del papel, la mezcla de analitos se distribuye entre las fases móvil y estacionaria y se separa sobre el papel en forma de manchas o rayas. La posición de las zonas componentes se determina revelando papel cromatográfico con los reactivos adecuados, que forman compuestos coloreados con los componentes de la mezcla que se separan.

Para cuantificar la capacidad de separar sustancias en un sistema cromatográfico, se utiliza el coeficiente de distribución K p, la relación entre la concentración de una sustancia en las fases estacionaria y móvil. La determinación experimental de los coeficientes de distribución con este método es imposible; para evaluar la capacidad de separar sustancias en papel, se utiliza el coeficiente de desplazamiento (movilidad) R f. El coeficiente de desplazamiento es igual a la relación entre la velocidad de movimiento de la sustancia () y la velocidad de movimiento de la fase móvil (
). Experimentalmente, el valor de R f se encuentra como la relación entre la distancia X recorrida por la sustancia y la distancia X f recorrida por el disolvente desde el inicio hasta la línea del frente:

El coeficiente Rf varía dentro del rango 0 – 1,00. El valor de Rf depende de la naturaleza de la sustancia que se determina, el tipo de papel cromatográfico, la calidad y naturaleza del disolvente, el método de aplicación de la muestra, la técnica experimental y la temperatura. El coeficiente Rf no depende de la concentración del analito ni de la presencia de otros componentes.

Identificación El cromatograma se realiza de las siguientes maneras:

comparación visual del color característico de zonas de sustancias en los cromatogramas estudiados y estándar;

midiendo los coeficientes de movilidad R f para el estándar y el analito en un disolvente específico. La cromatografía y la determinación de R f para las mezclas de prueba y estándar se llevan a cabo en el mismo papel y en la misma cámara en condiciones estrictamente idénticas. Comparando los coeficientes Rf, se llega a una conclusión sobre la presencia de ciertos componentes en la mezcla analizada.

cuantificación Se realiza directamente a partir del cromatograma o lavando (eluyendo) el analito del papel.

Métodos de análisis cuantitativo:

comparación visual de la intensidad del color de las manchas en la prueba y los cromatogramas estándar (determinación semicuantitativa, precisión del 15 al 20%);

medir el área de la mancha formada por un componente determinado y encontrar la concentración de la sustancia mediante un gráfico de calibración construido para una serie de soluciones estándar en las coordenadas: área de la mancha – concentración de la sustancia; precisión de determinación 5 – 10%;

elución del analito de la superficie del cromatograma y medición espectrofotométrica o fluorimétrica de la densidad óptica del eluato (A); La concentración de una sustancia en solución se calcula mediante la fórmula:

donde K es el coeficiente de proporcionalidad; S – área del punto, medida previamente, mm 2 ; precisión de determinación 1%.

Según el método de cromatografía, existen cromatografía ascendente (Fig. 21), descendente (Fig. 22), circular (Fig. 23), de gradiente y bidimensional.

	Arroz. 21. Cámara para cromatografía ascendente: 1 – tapón; 2 – gancho; 3 – recipiente de vidrio; 4 – tira de papel; 5 – solvente
	Arroz. 22. Cámara cromatográfica para cromatografía descendente: 1 – disolvente; 2 – travesaño para papel; 3 – tira de papel; 4 – recipiente de vidrio; 5 – solvente que fluye
	Arroz. 23. Separación de sustancias mediante cromatografía circular: 1 – papel cromatográfico; 2 – tapa; 3 – placa de Petri; 4 - disolvente orgánico

El método de cromatografía en papel se utiliza ampliamente para la determinación de compuestos inorgánicos, aminoácidos, aminas, proteínas, carbohidratos, ácidos grasos, fenoles, vitaminas en las industrias química, alimentaria, farmacéutica, medicina y bioquímica.

El método ha encontrado aplicación en el análisis de casi todos los productos alimenticios: en la producción de azúcar, para la determinación de carbohidratos; en panadería y confitería: aminoácidos, ácidos orgánicos, carbohidratos, polisacáridos y compuestos carbonílicos; en vinificación: ácidos orgánicos y aminoácidos; en la producción de leche y productos lácteos: aminoácidos; en la industria procesadora de carne: fenoles, ácidos grasos y volátiles, aminoácidos y compuestos carbonílicos.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL, método de separación, identificación y cuantificación de sustancias; una de las variantes planas de la cromatografía líquida, en la que se utiliza papel especial como fase estacionaria o soporte inerte de la fase estacionaria. El método de cromatografía en papel fue propuesto por A. Martin y R. Singh en 1944 para el análisis de mezclas de aminoácidos.

La separación de los componentes de la mezcla se produce debido a la distribución de sustancias entre la fase estacionaria y la fase móvil (eluyente); La estructura capilar del papel garantiza el movimiento uniforme del eluyente a lo largo de la capa de fase estacionaria. La transferencia de componentes por el eluyente se produce a diferentes velocidades según su coeficiente de distribución. Como resultado, en el cromatograma las sustancias forman zonas separadas (manchas), cuya posición se caracteriza por los valores de R f, la velocidad relativa de movimiento. Experimentalmente, el valor de R f se determina como la relación entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por el eluyente durante el mismo tiempo; R f ≤1; el valor Rf depende de la naturaleza de la sustancia, la composición de la fase móvil, el tipo de papel, la técnica experimental y no debe depender de la concentración de la sustancia que se está determinando ni de la presencia de otras sustancias. Las zonas coloreadas en el cromatograma se observan visualmente, las zonas no coloreadas se revelan con reactivos que forman compuestos coloreados o fluorescentes con los componentes de la mezcla que se separan. La identificación de sustancias puede basarse en una comparación de los valores R f de las soluciones de prueba y estándar. El análisis cuantitativo se realiza directamente sobre el cromatograma (por tamaño de punto, espectros de absorción o reflexión, mediante densitometría, radiometría, etc.) o después de la separación (por ejemplo, mediante extracción) de la sustancia de la zona cromatográfica de la base de celulosa (espectrofotométrica). , se utilizan métodos fluorimétricos, de absorción atómica para la determinación y otros métodos).

Los cromatogramas en papel se pueden obtener mediante movimiento ascendente, descendente u horizontal (radial) del eluyente; utilizando separaciones repetidas, se obtienen cromatogramas bidimensionales. La separación se realiza en cámaras cerradas (vasos, cilindros, etc.) saturadas de vapores de la fase móvil. Para separar compuestos hidrófilos se utiliza papel cromatográfico especial (hecho de fibras de celulosa) que contiene agua o intercambiadores de iones como fase estacionaria. Para separar compuestos insolubles en agua, el papel se hidrofoba mediante acetilación o impregnación con sustancias hidrófobas (parafina, caucho, reactivos orgánicos, etc.). Como eluyentes se utilizan diversos disolventes o sus mezclas, soluciones acuosas de ácidos orgánicos e inorgánicos, alcoholes, electrolitos, etc.

El método de cromatografía en papel se puede utilizar para analizar pequeñas cantidades (10 -9 -10 -6 g) de compuestos químicos de casi todas las clases. Por su sencillez técnica y accesibilidad, la cromatografía en papel se utiliza para detectar sustancias fácilmente separables, comprobar la identidad de compuestos orgánicos, determinar oligoelementos en análisis geoquímicos, etc.

Iluminado.: Cromatografía sobre papel. M., 1962; Cromatografía. Aplicación práctica del método. M., 1986. T. 1-2; Fundamentos de química analítica / Editado por Yu. A. Zolotov. 2da ed. M., 1999. Libro. 1.

Método de cromatografía en papel Hace referencia a la cromatografía plana, se basa en la distribución de analitos entre dos líquidos inmiscibles.

Tipos de papel de cromatografía:

1) el papel hidrófilo retiene hasta un 22% de agua en sus poros; fase estacionaria – agua, fase móvil – disolvente orgánico; Este papel se utiliza para determinar sustancias solubles en agua.

2) el papel hidrófobo repele el agua, por lo que se impregna con un disolvente orgánico apolar (fase estacionaria); fase móvil – agua; Este documento se utiliza para determinar compuestos insolubles en agua (ácidos liposolubles, vitaminas).

Los siguientes requisitos se aplican al papel cromatográfico:

¨ pureza química;

¨ neutralidad química y de adsorción en relación con las sustancias analizadas y la fase móvil;

¨ uniformidad en la densidad;

¨ orientación idéntica de las fibras.

Para cuantificar la capacidad de separar sustancias en un sistema cromatográfico, se utiliza el coeficiente de distribución K p, la relación entre la concentración de una sustancia en las fases estacionaria y móvil. La determinación experimental de los coeficientes de distribución con este método es imposible; para evaluar la capacidad de separar sustancias en papel, se utiliza el coeficiente de desplazamiento (movilidad) R f. El coeficiente de desplazamiento es igual a la relación entre la velocidad de movimiento de la sustancia () y la velocidad de movimiento de la fase móvil (). Experimentalmente, el valor de R f se encuentra como la relación entre la distancia X recorrida por la sustancia y la distancia X f recorrida por el disolvente desde el inicio hasta la línea del frente:

El coeficiente R f varía entre 0 y 1,00. El valor de Rf depende de la naturaleza de la sustancia que se determina, el tipo de papel cromatográfico, la calidad y naturaleza del disolvente, el método de aplicación de la muestra, la técnica experimental y la temperatura. El coeficiente Rf no depende de la concentración del analito ni de la presencia de otros componentes.

Identificación El cromatograma se realiza de las siguientes maneras:

¨ comparación visual del color característico de zonas de sustancias en los cromatogramas estudiados y estándar;

¨ medir los coeficientes de movilidad Rf para el estándar y el analito en un disolvente específico. La cromatografía y la determinación de R f para las mezclas de prueba y estándar se llevan a cabo en el mismo papel y en la misma cámara en condiciones estrictamente idénticas. Comparando los coeficientes Rf, se llega a una conclusión sobre la presencia de ciertos componentes en la mezcla analizada.

cuantificación Se realiza directamente a partir del cromatograma o lavando (eluyendo) el analito del papel.

Métodos de análisis cuantitativo:

¨ comparación visual de la intensidad del color de las manchas en la prueba y los cromatogramas estándar (determinación semicuantitativa, precisión del 15 al 20%);

¨ medir el área de la mancha formada por un componente determinado y encontrar la concentración de la sustancia mediante un gráfico de calibración construido para una serie de soluciones estándar en las coordenadas: área de la mancha – concentración de la sustancia; precisión de determinación 5 – 10%;

¨ elución del analito de la superficie del cromatograma y medición espectrofotométrica o fluorimétrica de la densidad óptica del eluato (A); La concentración de una sustancia en solución se calcula mediante la fórmula:

donde K es el coeficiente de proporcionalidad; S – área del punto, medida previamente, mm 2 ; precisión de determinación 1%.

Según el método de cromatografía, existen cromatografía ascendente (Fig. 21), descendente (Fig. 22), circular (Fig. 23), de gradiente y bidimensional.

Sobre papel (a. cromatografía en papel; n. Papierchromographie; f. Chromatographie sur papier; i. cromatografia sobre papel): un método para separar y analizar mezclas de sustancias en función de su distribución entre las fases líquidas móvil y estacionaria; El papel se utiliza como portador de la fase líquida estacionaria. El método fue propuesto por los científicos ingleses A. Martin y R. Shingo en 1941.

En la cromatografía en papel se utilizan grados especiales de papel, que difieren en número y, a medida que aumentan, aumenta la densidad del papel. El papel retiene agua en sus poros, que es la fase líquida estacionaria. La solución de muestra se aplica en forma de gotas sobre una hoja de papel a cierta distancia del borde. Una vez que el disolvente se ha evaporado, el borde de la lámina se coloca en una cámara sellada que contiene un revelador: una fase líquida móvil (por ejemplo, alcoholes, cetonas, fenoles, tetracloruro, cloroformo y otras mezclas de los mismos, así como mezclas con disolventes inorgánicos). ). En este caso, la mancha inicial se mueve a lo largo de la corriente del revelador y la mezcla se separa en componentes. Si las sustancias no están coloreadas, el cromatograma se revela, por ejemplo, rociando con una solución indicadora, examinando con rayos ultravioleta, etc. La relación entre la distancia Rf recorrida por el punto I y la distancia recorrida por la parte frontal del revelador m, bajo las mismas condiciones experimentales, es un valor constante; Los valores de Rf varían para diferentes sustancias y pueden usarse para identificar compuestos. Las determinaciones cuantitativas de diversas sustancias en puntos del cromatograma se llevan a cabo utilizando métodos analíticos convencionales. Hay cromatogramas unidimensionales, bidimensionales, circulares, de columna y electroforéticos (Fig.).

Los cromatogramas unidimensionales se registran utilizando el método descrito anteriormente. Un cromatograma bidimensional se obtiene separando puntos de un cromatograma unidimensional con otro revelador en una dirección perpendicular a la primera fila de puntos. En un cromatograma circular, una mancha situada en el centro de la hoja se difumina a lo largo de círculos concéntricos. En la cromatografía en columna de papel, la separación se lleva a cabo en discos de papel insertados firmemente en una columna cilíndrica. Para obtener cromatogramas electroforéticos se impregna una hoja de papel con un electrolito, se fija entre los electrodos, se aplica la mezcla analizada, se conectan los electrodos a una fuente de corriente continua, y al mismo tiempo se aplica al papel un solvente móvil en un dirección perpendicular a la dirección de las líneas de corriente eléctrica. En este método, la separación de los componentes se produce debido a su distribución desigual entre las dos fases líquidas y a las diferentes velocidades de movimiento de las sustancias bajo la influencia de un campo eléctrico.

La cromatografía en papel se utiliza para separar y analizar sustancias orgánicas e inorgánicas en materiales naturales e industriales (por ejemplo, determinar resinas en productos derivados del petróleo, elementos de tierras raras en y).

Debido a que el papel cromatográfico utilizado en este método (grados especiales de papel de filtro) contiene agua (20-22%) en los poros, se utilizan disolventes orgánicos como otra fase. El uso de cromatografía sobre papel tiene una serie de desventajas importantes: la dependencia del proceso de separación de la composición y propiedades del papel, cambios en el contenido de agua en los poros del papel cuando cambian las condiciones de almacenamiento, una velocidad de cromatografía muy baja ( hasta varios días) y baja reproducibilidad de los resultados. Estas deficiencias afectan seriamente la difusión de la cromatografía en papel como método cromatográfico.

Cromatografía de capa fina

En este método, la cromatografía de sustancias se produce en una fina capa de sorbente depositada sobre un sustrato sólido y plano. La separación en este método se basa principalmente en sorción-desorción. El uso de varios sorbentes permitió ampliar y mejorar significativamente este método.

Al principio del método, las placas debían fabricarse de forma independiente. Pero hoy en día se utilizan principalmente placas fabricadas en fábrica, que tienen una gama bastante amplia de tamaños, soportes y sustratos.

Una placa cromatográfica moderna está hecha de vidrio, aluminio o polímero (por ejemplo, politereftalato). Debido a que la base de vidrio es cada vez menos popular (a menudo se rompe, es imposible dividir la placa en varias partes sin dañar la capa absorbente, pesa mucho), las placas más utilizadas son las que utilizan papel de aluminio. o polímeros como bases.

Para fijar el sorbente se utilizan yeso, almidón, sol de sílice, etc., que sujetan los granos de sorbente sobre el sustrato. El espesor de la capa puede ser diferente (100 o más micrones), pero el criterio más importante es que la capa debe tener un espesor uniforme en cualquier lugar de la placa cromatográfica.

Sorbentes

El sorbente más común es el gel de sílice.

El gel de sílice es ácido silícico hidratado, formado por la acción de ácidos minerales sobre el silicato de sodio y el secado del sol resultante. Después de moler el sol, se utiliza una fracción de un determinado tamaño de grano (indicado en la placa, normalmente de 5 a 20 micrones).

El gel de sílice es un sorbente polar en el que los grupos -OH sirven como centros activos. Absorbe fácilmente agua en la superficie y forma enlaces de hidrógeno.

Alúmina. El óxido de aluminio es un adsorbente débilmente básico y se utiliza principalmente para la separación de compuestos débilmente básicos y neutros. La desventaja de las placas de óxido de aluminio es la activación obligatoria de la superficie antes de su uso en un horno a altas temperaturas (100-150 0 C) y la baja capacidad de adsorción de la capa en comparación con el gel de sílice.

La tierra de diatomeas es un adsorbente que se obtiene a partir de minerales naturales: las tierras de diatomeas. El sorbente tiene propiedades hidrófilas, pero una menor capacidad de adsorción de la capa en comparación con el gel de sílice. El silicato de magnesio es menos polar que el gel de sílice y generalmente se usa en casos donde adsorbentes más polares no proporcionan una separación efectiva.

Celulosa: las placas de capa fina recubiertas con celulosa son muy eficaces para separar moléculas orgánicas complejas. El adsorbente se compone principalmente de perlas de celulosa con un diámetro de hasta 50 micrones, fijadas a un soporte con almidón. Pero, como en la cromatografía en papel, el ascenso del frente del disolvente se produce muy lentamente.

En las placas cromatográficas de intercambio iónico se utilizan como adsorbente resinas de intercambio iónico que contienen amonio cuaternario o grupos sulfo activos implicados en el intercambio iónico. La cromatografía en capa fina con este tipo de placas se realiza con fases móviles que contienen ácidos o álcalis fuertes. Estas placas son efectivas para separar compuestos anfóteros y de alto peso molecular.

Los sorbentes anteriores son los más comunes, pero además de estos, existen muchas sustancias que se utilizan como sorbentes. Estos son talco, sulfato de calcio, almidón, etc.

Al mismo tiempo, incluso los sorbentes ya mencionados se pueden modificar para darles nuevas propiedades de sorción (impregnación de sorbentes con reactivos, por ejemplo AgNO 3, creación de placas con fase inversa). Es esta variedad de fases posibles a un costo mínimo lo que hace posible utilizar TLC para la cromatografía de una gran cantidad de sustancias.

Solventes

En la cromatografía en capa fina se utilizan como fase móvil sustancias puras (acetato de etilo, benceno, etc.) o mezclas de sustancias (sistemas) en una determinada proporción.

La selección de la fase móvil (sistema) se realiza de acuerdo con las siguientes reglas:

· Elija un sistema en el que los componentes separados tengan baja solubilidad (si la solubilidad de la sustancia es alta, entonces las sustancias se moverán con el frente, si la solubilidad es baja, permanecerán al principio). En la cromatografía de partición o en el uso de fases inversas, la solubilidad de las sustancias debe ser mayor en la fase móvil que en la fase estacionaria.

· La composición del sistema debe ser constante y fácilmente reproducible.

· El disolvente o los componentes del sistema no deben ser tóxicos o deficientes.

· El sistema debe separar completamente sustancias de estructura similar, y las diferencias en Rf deben ser al menos 0,05.

· El sistema no debe causar cambios químicos en los componentes separados.

· En el sistema elegido, los analitos deben tener diferentes valores de R f y estar distribuidos a lo largo de toda la longitud del cromatograma. Es deseable que los valores de R f estén en el rango de 0,05 a 0,85.

· Al elegir un sistema, también es necesario tener en cuenta la naturaleza de las sustancias separadas. Así, cuando se cromatografían sustancias con propiedades básicas, el sistema no debe tener propiedades ácidas y viceversa.

Preparación de platos

Cuando se utilizan placas compradas, primero se deben preparar para la cromatografía. Esto se debe al hecho de que los adsorbentes de placas durante el almacenamiento absorben no solo la humedad, sino también otras sustancias contenidas en el aire. Cuando se utilizan placas no preparadas durante el proceso de cromatografía, aparece un frente de "suciedad" que puede interferir con la determinación de sustancias con valores R f grandes, y algunas sustancias, como el agua, pueden cambiar la composición de la fase móvil, cambiando así la valores Rf obtenidos.

La preparación preliminar de las placas consiste en esparcir las placas con un disolvente puro en toda la altura de la placa (metanol, benceno, éter dietílico), seguido de secar la placa en una estufa a una temperatura de 110-120 0C durante 0,5-1 hora. De esta forma se pueden preparar varios platos a la vez y, almacenados en un lugar seco y cerrado, conservar sus propiedades durante varios meses.

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