Техника проведения бумажной хроматографии рисунки. Хроматография на бумаге (БХ). Методики хроматографического разделения
Метод хроматографии на бумаге относится к плоскостной хроматографии, он основан на распределении анализируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.
В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Вещество присутствует в обеих фазах в виде раствора. Неподвижная фаза удерживается в порах хроматографической бумаги, не взаимодействуя с ней, бумага выполняет функцию носителя неподвижной фазы.
Виды хроматографической бумаги:
гидрофильная бумага удерживает в порах до 22 % воды; неподвижная фаза – вода, подвижная – органический растворитель; такая бумага применяется для определения водорастворимых веществ.
гидрофобная бумага отталкивает воду, поэтому ее пропитывают неполярным органическим растворителем (неподвижная фаза); подвижная фаза – вода; такая бумага применяется для определения нерастворимых в воде соединений (жирорастворимые кислоты, витамины).
К хроматографической бумаге предъявляются следующие требования:
химическая чистота;
химическая и адсорбционная нейтральность по отношению к анализируемым веществам и подвижной фазе;
однородность по плотности;
одинаковая направленность волокон.
Для получения хроматограммы на бумагу наносят каплю анализируемой смеси. Бумагу помещают в хроматографическую камеру, ее конец погружают в сосуд с элюентом. Растворитель продвигается по бумаге, смесь анализируемых веществ распределяется между подвижной и неподвижной фазами и разделяется на бумаге в виде пятен или полос. Положение зон компонентов определяют проявлением хроматографической бумаги соответствующими реагентами, которые с компонентами разделяемой смеси образуют окрашенные соединения.
Для
количественной оценки способности
разделения веществ в хроматографической
системе применяют коэффициент
распределения К р
– отношение концентрации вещества в
неподвижной и подвижной фазах.
Экспериментальное установление
коэффициентов распределения в данном
методе невозможно, для оценки способности
разделения веществ на бумаге применяют
коэффициент смещения (подвижности) R f .
Коэффициент смещения равен отношению
скорости движения вещества ()
к скорости движения подвижной фазы ().
Экспериментально величину R f
находят как отношение расстояния Х,
пройденного веществом, к расстоянию
Х f ,
пройденному растворителем от старта
до линии фронта:
.
Коэффициент R f изменяется в пределах 0 – 1,00. Величина R f зависит от природы определяемого вещества, вида хроматографической бумаги, качества и природы растворителя, способа нанесения пробы, техники эксперимента и температуры. Коэффициент R f не зависит от концентрации определяемого вещества и присутствия других компонентов.
Идентификацию по хроматограмме выполняют следующими способами:
визуальным сравнением характерной окраски зон веществ на исследуемой и стандартной хроматограммах;
измерением коэффициентов подвижности R f для стандартного и анализируемого вещества в определенном растворителе. Хроматографирование и установление R f для исследуемой и стандартной смесей проводят на одинаковой бумаге и в одной камере в строго идентичных условиях. Сопоставляя коэффициенты R f , делают заключение о присутствии в анализируемой смеси тех или иных компонентов.
Количественное определение выполняют непосредственно по хроматограмме или при вымывании (элюировании) анализируемого вещества с бумаги.
Способы количественного анализа:
визуальное сравнение интенсивности окраски пятен на исследуемой и стандартной хроматограммах (полуколичественное определение, точность 15 –20 %);
измерение площади пятна, образованного данным компонентом, и нахождение концентрации вещества по градуировочному графику, построенному для серии стандартных растворов в координатах: площадь пятна – концентрация вещества; точность определения 5 – 10 %;
элюирование определяемого вещества с поверхности хроматограммы и спектрофотометрическое или флуориметрическое измерение оптической плотности элюата (А); концентрацию вещества в растворе рассчитывают по формуле:
,
где К – коэффициент пропорциональности; S – площадь пятна, измеренная предварительно, мм 2 ; точность определения 1 %.
По способу хроматографирования различают восходящую (рис. 21), нисходящую (рис. 22), круговую (рис. 23), градиентную и двухмерную хроматографии.
Рис. 21. Камера для восходящей хроматографии: 1 – пробка; 2 – крючок; 3 – стеклянный сосуд; 4 – полоска бумаги; 5 – растворитель |
|
Рис. 22. Хроматографическая камера для нисходящей хроматографии: 1 – растворитель; 2 – перекладина для бумаги; 3 – полоска бумаги; 4 – стеклянный сосуд; 5 – стекающий растворитель |
|
Рис. 23. Разделение веществ методом круговой хроматографии: 1– хроматографическая бумага; 2 – крышка; 3 – чашка Петри; 4 – органический растворитель |
Метод хроматографии на бумаге широко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии.
Метод нашел применение в анализе практически всех пищевых продуктов: в сахарном производстве – для определения углеводов; в хлебопекарном и кондитерском – аминокислот, органических кислот, углеводов, полисахаридов и карбонильных соединений; в виноделии – органических кислот и аминокислот; в производстве молока и молочных продуктов – аминокислот; в мясоперерабатывающей промышленности – фенолов, жирных и летучих кислот, аминокислот и карбонильных соединений.
БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, метод разделения, идентификации и количественного определения веществ; один из плоскостных вариантов жидкостной хроматографии, в котором в качестве неподвижной фазы или инертного носителя неподвижной фазы используют специальную бумагу. Метод бумажной хроматографии предложен А. Мартином и Р. Сингом в 1944 году для анализа смесей аминокислот.
Разделение компонентов смеси происходит вследствие распределения веществ между неподвижной фазой и подвижной (элюентом); равномерное продвижение элюента вдоль слоя неподвижной фазы обеспечивается капиллярной структурой бумаги. Перенос компонентов элюентом происходит с различными скоростями в соответствии с их коэффициентом распределения. В результате на хроматограмме вещества образуют отдельные зоны (пятна), положение которых характеризуется величинами R f - относительной скоростью перемещения. Экспериментально величину R f определяют как отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному за это же время элюентом; R f ≤1; величина R f зависит от природы вещества, состава подвижной фазы, типа бумаги, техники эксперимента и не должна зависеть от концентрации определяемого вещества и присутствия других веществ. Окрашенные зоны на хроматограмме наблюдают визуально, неокрашенные проявляют реагентами, образующими с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Идентификация веществ может быть основана на сопоставлении величин R f исследуемого и стандартного растворов. Количественный анализ осуществляют непосредственно на хроматограмме (по размеру пятна, спектрам поглощения или отражения, с помощью денситометрии, радиометрии и пр.) или после отделения (например, экстрагированием) вещества хроматографической зоны от целлюлозной основы (для определения используют спектрофотометрические, флуориметрические, атомно-абсорбционные и другие методы).
Бумажные хроматограммы можно получать путём восходящего, нисходящего или горизонтального (радиального) движения элюента; используя повторное разделение, получают двухмерные хроматограммы. Разделение проводят в закрытых камерах (стаканах, цилиндрах и др.), насыщенных парами подвижной фазы. Для разделения гидрофильных соединений используют специальную хроматографическую бумагу (из целлюлозных волокон), содержащую в качестве неподвижной фазы воду или иониты. Для разделения нерастворимых в воде соединений бумагу гидрофобизируют ацетилированием или пропиткой гидрофобными веществами (парафин, каучук, органические реагенты и др.). В качестве элюентов используют различные растворители или их смеси, водные растворы органических и неорганических кислот, спиртов, электролитов и пр.
Методом бумажной хроматографии можно анализировать малые количества (10 -9 -10 -6 г) химических соединений практически всех классов. Благодаря технической простоте и доступности бумажную хроматографию используют при обнаружении легко разделяемых веществ, при проверке индивидуальности органических соединений, определении следов элементов в геохимическом анализе и пр.
Лит.: Хроматография на бумаге. М., 1962; Хроматография. Практическое приложение метода. М., 1986. Т. 1-2; Основы аналитической химии / Под редакцией Ю. А. Золотова. 2-е изд. М., 1999. Кн. 1.
Метод хроматографии на бумаге относится к плоскостной хроматографии, он основан на распределении анализируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.
В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Вещество присутствует в обеих фазах в виде раствора. Неподвижная фаза удерживается в порах хроматографической бумаги, не взаимодействуя с ней, бумага выполняет функцию носителя неподвижной фазы.
Виды хроматографической бумаги:
1) гидрофильная бумага удерживает в порах до 22 % воды; неподвижная фаза – вода, подвижная – органический растворитель; такая бумага применяется для определения водорастворимых веществ.
2) гидрофобная бумага отталкивает воду, поэтому ее пропитывают неполярным органическим растворителем (неподвижная фаза); подвижная фаза – вода; такая бумага применяется для определения нерастворимых в воде соединений (жирорастворимые кислоты, витамины).
К хроматографической бумаге предъявляются следующие требования:
¨ химическая чистота;
¨ химическая и адсорбционная нейтральность по отношению к анализируемым веществам и подвижной фазе;
¨ однородность по плотности;
¨ одинаковая направленность волокон.
Для получения хроматограммы на бумагу наносят каплю анализируемой смеси. Бумагу помещают в хроматографическую камеру, ее конец погружают в сосуд с элюентом. Растворитель продвигается по бумаге, смесь анализируемых веществ распределяется между подвижной и неподвижной фазами и разделяется на бумаге в виде пятен или полос. Положение зон компонентов определяют проявлением хроматографической бумаги соответствующими реагентами, которые с компонентами разделяемой смеси образуют окрашенные соединения.
Для количественной оценки способности разделения веществ в хроматографической системе применяют коэффициент распределения К р – отношение концентрации вещества в неподвижной и подвижной фазах. Экспериментальное установление коэффициентов распределения в данном методе невозможно, для оценки способности разделения веществ на бумаге применяют коэффициент смещения (подвижности) R f . Коэффициент смещения равен отношению скорости движения вещества () к скорости движения подвижной фазы (). Экспериментально величину R f находят как отношение расстояния Х, пройденного веществом, к расстоянию Х f , пройденному растворителем от старта до линии фронта:
.
Коэффициент R f изменяется в пределах 0 – 1,00. Величина R f зависит от природы определяемого вещества, вида хроматографической бумаги, качества и природы растворителя, способа нанесения пробы, техники эксперимента и температуры. Коэффициент R f не зависит от концентрации определяемого вещества и присутствия других компонентов.
Идентификацию по хроматограмме выполняют следующими способами:
¨ визуальным сравнением характерной окраски зон веществ на исследуемой и стандартной хроматограммах;
¨ измерением коэффициентов подвижности R f для стандартного и анализируемого вещества в определенном растворителе. Хроматографирование и установление R f для исследуемой и стандартной смесей проводят на одинаковой бумаге и в одной камере в строго идентичных условиях. Сопоставляя коэффициенты R f , делают заключение о присутствии в анализируемой смеси тех или иных компонентов.
Количественное определение выполняют непосредственно по хроматограмме или при вымывании (элюировании) анализируемого вещества с бумаги.
Способы количественного анализа:
¨ визуальное сравнение интенсивности окраски пятен на исследуемой и стандартной хроматограммах (полуколичественное определение, точность 15 –20 %);
¨ измерение площади пятна, образованного данным компонентом, и нахождение концентрации вещества по градуировочному графику, построенному для серии стандартных растворов в координатах: площадь пятна – концентрация вещества; точность определения 5 – 10 %;
¨ элюирование определяемого вещества с поверхности хроматограммы и спектрофотометрическое или флуориметрическое измерение оптической плотности элюата (А); концентрацию вещества в растворе рассчитывают по формуле:
где К – коэффициент пропорциональности; S – площадь пятна, измеренная предварительно, мм 2 ; точность определения 1 %.
По способу хроматографирования различают восходящую (рис. 21), нисходящую (рис. 22), круговую (рис. 23), градиентную и двухмерную хроматографии.
Метод хроматографии на бумаге широко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии.
Метод нашел применение в анализе практически всех пищевых продуктов: в сахарном производстве – для определения углеводов; в хлебопекарном и кондитерском – аминокислот, органических кислот, углеводов, полисахаридов и карбонильных соединений; в виноделии – органических кислот и аминокислот; в производстве молока и молочных продуктов – аминокислот; в мясоперерабатывающей промышленности – фенолов, жирных и летучих кислот, аминокислот и карбонильных соединений.
На бумаге (а. paper chromatography; н. Papierchromatographie; ф. Chromatographie sur papier; и. cromatografia sobre papel), — метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на их распределении между подвижной и неподвижной жидкими фазами; в качестве носителя неподвижной жидкой фазы используют бумагу. Метод предложен английскими учёными А. Мартином и Р. Синго в 1941.
В бумажной хроматографии используют специальные сорта бумаги, различающиеся по номерам, с возрастанием которых плотность бумаги увеличивается. Бумага удерживает в порах воду, которая и является неподвижной жидкой фазой. Раствор пробы наносят в виде капель на лист бумаги на некотором расстоянии от края. После испарения растворителя край листа помещают в герметическую камеру, содержащую проявитель — подвижную жидкую фазу (например, спирты, кетоны, фенолы, четырёххлористый , хлороформ и другие их смеси, а также смеси с неорганическими растворителями). При этом происходит передвижение исходного пятна по току проявителя и разделение смеси на компоненты. Если вещества не окрашены, то хроматограмму проявляют, например, опрыскиванием раствором индикатора, рассматривают в ультрафиолетовых лучах и пр. Отношение расстояния Rf, пройденного пятном I, к расстоянию, пройденному фронтом проявителя m, при одинаковых условиях эксперимента является постоянной величиной; Rf для различных веществ отличаются по значению и могут быть использованы для идентификации соединений. Количественные определения различных веществ в пятнах хроматограммы ведутся обычными аналитическими методами. Различают одномерные, двумерные, круговые, колоночные и электрофоретические хроматограммы (рис.).
Описанным выше способом регистрируют одномерные хроматограммы. Двумерную хроматограмму получают разделением пятен одномерной хроматограммы другим проявителем в направлении, перпендикулярном первому ряду пятен. На круговой хроматограмме пятно, помещённое в центре листа, размывают по концентрическим окружностям. В колоночной бумажной хроматографии разделение проводят на бумажных дисках, плотно вставленных в цилиндрическую колонку. Для получения электрофоретических хроматограмм бумажный лист пропитывают электролитом, закрепляют между электродами, наносят анализируемую смесь, подключают электроды к источнику постоянного тока и одновременно на бумагу подают подвижный растворитель в направлении, перпендикулярном направлению силовых линий электрического тока. В этом методе разделение компонентов происходит вследствие их неодинакового распределения между двумя жидкими фазами и разной скорости перемещения веществ под действием электрического поля.
Бумажную хроматографию используют для разделения и анализа неорганических и органических веществ в природных и промышленных материалах (например, определяют смолы в нефтепродуктах, редкоземельные элементы в и ).
В связи с тем, что используемая в этом методе хроматографическая бумага (специальные сорта фильтровальной бумаги) содержат в порах воду (20-22%), в качестве другой фазы используются органические растворители. Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода.
Тонкослойная хроматография
В этом методе хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции. Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод.
В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. Но на сегодняшний день в основном используются пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам.
Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например политерефталат). В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры.
Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.
Сорбенты
Наиболее распространенным сорбентом является силикагель.
Силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм).
Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служит группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.
Окись алюминия. Окись алюминия является слабо основным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100-150 0 С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.
Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем. Кремнекислый магний менее полярный чем силикагель и обычно используется в случаях, когда более полярные адсорбенты не дали эффективного разделения.
Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Но, как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.
В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента используют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или активные сульфогруппы, участвующие в ионном обмене. Тонкослойная хроматография с такого типа пластинками, проводится с подвижными фазами содержащими сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений.
Вышеперечисленные сорбенты являются наиболее распространенными, но помимо этих существуют множество веществ, используемых как сорбенты. Это тальк, сульфат кальция, крахмал и т.д..
В то же время даже уже указанные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств (пропитка сорбентов реактивами, например AgNO 3 , создание пластин с обращенной фазой). Именно такое разнообразие возможных фаз при минимальных затратах позволяют использовать ТСХ для хроматографирования огромного числа веществ.
Растворители
В тонкослойной хроматографии, в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо смеси веществ (системы) в определенном соотношении.
Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам:
· Выбирают такую систему, в которой разделяемые компоненты имеют небольшую растворимость (если растворимость вещества высокая, то вещества будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте). При распределительной хроматографии или при использовании обращенных фаз, растворимость веществ должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной.
· Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.
· Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.
· Система должна полностью разделять вещества близкого строения, причем различия в R f должно быть не менее 0,05.
· Система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов.
· В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения R f и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения R f лежало в пределах 0,05-0,85.
· При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ. Так, при хроматографировании веществ, имеющих основные свойства система не должна обладать кислотными свойствами и наоборот.
Подготовка пластин
При использовании приобретенных пластин, для хроматографирования их необходимо предварительно подготовить. Это связано с тем, что адсорбенты пластин при хранении сорбируют не только влагу, но и другие вещества, содержащиеся в воздухе. При использовании неподготовленных пластин в процессе хроматографирования появляется фронт "грязи", который может мешать определению веществ, имеющие большие значения R f , а некоторые вещества, например вода, может изменять состав подвижной фазы, изменяя тем самым получаемые значения R f .
Предварительная подготовка пластин заключается в разгонке пластин чистым растворителем на всю высоту пластинки (метанол, бензол, диэтиловый эфир),с последующей сушкой пластины в сушильном шкафу при температуре 110-120 0С в течении 0,5-1 часа. Таким способом можно подготовить сразу несколько пластин и при хранении их в сухом герметичном месте, сохраняют свои свойства несколько месяцев.